故事发生在明朝年间，皇后深得皇帝宠爱，且诞下龙嗣，太师庞飞（黄达亮 饰）害怕身为贵妃的妹妹因此失宠，设了一出狸猫换太子之计，害得皇后被打入冷宫，太子亦不知去向。一晃眼数十年过去，在一场科举考试之中，柳景（何贵林 饰）的养子柳生（吕颂贤 饰）本夺得了状元之位，却被庞飞的养子元旦（何宝生 饰）取而代之，柳生心中很是愤愤不平。　　之后，柳生偶遇了妙龄少女段玉（蒋勤勤 饰），两人在阴差阳错之下结缘，彼此情愫渐生。之后，段玉之父因护送夜明珠一事遭人先喊身陷囹圄，于是段玉女扮男装混入了衙门，希望能够查明事件的真相。在衙门里，段玉和当差的柳生重逢了，然而柳生却并没有认出眼前英姿勃发的青年正是自己的爱人。

苏州二公差是一部以苏州民间传说为蓝本，讲述了明代苏州城里“二公差”宋大均与董升在办案中屡破奇案，平抑民间盗贼，处置平争斗的故事。

故事从苏州城里盛行的造假行为开始。两位主角宋大均与董升也因此相遇，两人因为各自的专业知识及性格互补，成为了配合默契的搭档。他们通过调查，最终揭穿了早已骗取民间信任的“方佬掌柜”走私贩毒，被称为官府以外的“大英雄”。

尽管案子一件件成功告破，二公差仍面临着许多阻碍和危险。他们被敌对势力盯上，遭遇各种诡计和陷阱。其间还涉及到了诸如迷红墙、宝童、雀斑女、寻找真爱等浪漫又神秘的元素。

除此之外，二公差的故事还关于苏州城里的常识和文化。他们在观察案情、调查线索时，常常追寻蹊跷，从士绅的婚姻家庭、经济交易等方面入手，揭示出一张区别于生活外部的社会生态图景，带我们回到那个广阔的古代时空。苏州城与周遭乡亲传说、活动的介绍，散发出西楼、山塘街等地方的生活气息。

整个电视剧的画面设置在苏州城内外，描绘了依水而建的苏州城及其奢华龙蟠耳建筑，也融入了苏州园林、绣花巷等地方的特色，使得观众寓目方远之余，更能领略古都的历史文脉和人情味。简言之，苏州二公差是集文学、文化、生活于一身的影视作品，深入浅出地夹带着趣味、智慧与内涵。